引言

昨天我们通过甲状腺眼病（TED）的多组学研究，学会了从疾病差异中“正向”挖掘潜在靶点。但科研中更常见的场景是：一款药物在临床或实验中已展现出疗效（列如能抑制肿瘤生长、缓解炎症），却没人知道它具体“作用于哪个分子”——就像手握能开锁的钥匙，却找不到对应的锁芯。

今天“药物靶点研究3天入门”的第二天，我们聚焦基于表型的药物研发（Phenotypic Drug Discovery, PDD），结合结直肠癌、罕见病、药物安全性研究的高分案例，拆解如何从“药物表型”反向锁定“治疗靶点”、排查“脱靶靶点”、挖掘“新用途”，同时引入PDD的核心原则——“可转化链（Chain of Translatability）”，确保表型与疾病机制的强关联。

核心逻辑【药物表型=靶点线索+安全预警+新适应症窗口】

PDD 的核心是“先观效果（表型），再溯机制（靶点）”：通过实验观察药物对细胞、动物或患者的生理/病理改变（如细胞凋亡增加、炎症减轻、肿瘤缩小），再反向追溯调控这一表型的分子靶点。

其价值不仅在于破解“药效明确但靶点模糊”的困境，更能通过表型与疾病机制的分子关联，延伸三大核心应用：

⩤   找“治疗靶点”：明确药物发挥疗效的核心分子，为后续药物优化（如提高靶点特异性）提供方向；

⩤   抓“脱靶靶点”：发现导致药物不良反应的“非预期作用分子”，规避研发风险；

⩤   挖“新用途”：从已批准药物的表型中，发现其原本适应症之外的新功效，实现“老药新用”。

关键操作【三类场景+高分案例，拆解PDD反向找靶点的具体路径】

PDD像“从药效追靶点”的科研侦探行动——跟着“表型线索”（如细胞自噬、肿瘤缩小）顺藤摸瓜，锁定调控效果的“靶点真凶”，核心就是“表型导向→靶点验证”。

不同“案件场景”（即找治疗靶点、查脱靶缘由、挖老药新用），要配不同“侦查工具”（如LiP-SMap、SIP、高通量筛选）。

下面丸子将结合3篇高分文献当“案例手册”，带大家拆解每种场景的“破案步骤”。

场景1：找药物的“治疗靶点”——从“自噬表型”锁定结直肠癌靶点PP2A

案例来源：《Cancer Letters》（IF=9.7）2021年的研究，聚焦降脂药洛美他派（lomitapide）重新定位为结肠直肠癌（Colorectal cancer, CRC）治疗药物的靶点挖掘。

核心技术：

有限蛋白酶解-质谱（LiP-SMap）、表面等离子体共振（SPR）、CRISPR-Cas9敲除

拆解步骤：

1. 确定表型：

⩤   洛美他派处理 CRC 细胞48h后，增殖抑制 65%，克隆形成数减少 40 %；

同时，自噬标志物LC3-II/LC3-I比值升高2.5倍，p62蛋白水平下降50 %；

【提示自噬激活是洛美他派抑制CRC的核心表型】

⩤   动物实验中，洛美他派（20mg/kg，每周2次）处理裸鼠移植瘤，肿瘤体积缩小75%，且无肝肾功能损伤。

2. 初筛靶点：

CRC 细胞裂解液 + 20μM 洛美他派共孵 48h 后，经LiP-SMap 技术筛选，质谱鉴定出 12 个候选蛋白，其中蛋白磷酸酶 2A（PP2A） 差异最显著且关联自噬通路，成为核心靶点。

3. 验证靶点：

⩤   CRISPR-Cas9敲除HCT116细胞PP2A基因后，洛美他派无法再激活自噬，增殖抑制率从65%降至20%；

【证明PP2A是洛美他派发挥药效的必需靶点】

⩤   SPR 验证洛美他派与 PP2A 直接结合。

4. 机制确认：

洛美他派结合PP2A后，抑制其磷酸酶活性，导致AMPKα 磷酸化水平升高；磷酸化的AMPK进一步磷酸化Beclin1，增强Beclin1与Atg14、Vps34的相互作用，最终激活自噬通路，形成完整机制链。

场景 2：分析药物的 “脱靶靶点”——从“肝毒性”追溯格尔德霉素的脱靶 NDUFV1

案例来源：《Analytical Chemistry》（IF=8.0）2019年的研究，探究热休克蛋白 90（HSP90）抑制剂格尔德霉素（geldanamycin）肝毒性的脱靶机制。

核心技术：溶剂诱导蛋白沉淀（SIP）、定量蛋白质组学、Western blot验证

拆解步骤：

1. 发现不良反应：

格尔德霉素因强效抑制 HSP90 进入临床，但 Ⅰ 期试验中 30% 患者出现剂量依赖性肝毒性，且与 HSP90 抑制活性无直接关联，提示存在脱靶靶点介导的毒性。

2. 筛选脱靶蛋白：

采用 SIP 技术，将 HeLa 细胞裂解液与格尔德霉素共孵育后，诱导蛋白沉淀，通过定量质谱比较上清中蛋白丰度差异显示：除已知靶点 HSP90 家族外，线粒体复合体 Ⅰ 亚基 NDUFV1 和 NDUFAB1 的可溶性丰度显著升高，提示可能为脱靶靶点。

3. 验证脱靶效应：

⩤   Western blot 验证：17% A.E.A. 处理下，未加格尔德霉素的 NDUFV1 几乎完全沉淀，而加药组 NDUFV1 仍保持 60% 可溶性，证明格尔德霉素能稳定 NDUFV1；

⩤   剂量依赖实验：格尔德霉素对 NDUFV1 的半饱和浓度远高于HSP90 ，提示高剂量时才会显著结合 NDUFV1。

4. 关联不良反应：

NDUFV1 是线粒体呼吸链复合体 Ⅰ 的核心亚基，负责 NADH 氧化和 ATP 生成。格尔德霉素结合 NDUFV1 后，抑制复合体 Ⅰ 活性，导致线粒体 ROS 生成增加 2 倍、ATP 水平下降 40%—— 与临床肝毒性（线粒体损伤）吻合，为药物结构优化提供方向。

场景 3：挖掘药物的 “新用途”——从 “TGFβ通路异常”挖掘氯沙坦治疗大疱性表皮松解症

案例来源：《Nature Reviews Drug Discovery》（IF=114.8）2017 年的研究，探索降压药氯沙坦（losartan）用于罕见病隐性营养不良型大疱性表皮松解症（RDEB）。

核心技术：患者来源细胞模型、动物模型验证、通路分析

拆解步骤：

1. 确定新表型需求：

RDEB 是由 COL7A1 基因突变导致的罕见病，患者皮肤因胶原纤维异常易破裂，现有治疗仅能对症处理。转录组分析显示，RDEB 患者皮肤成纤维细胞中TGFβ 通路基因表达升高，提示抑制该通路可能缓解病情。

2. 筛选药物库：

对 1200 种 FDA 批准药物进行高通量筛选，检测其对 RDEB 成纤维细胞 TGFβ 通路的抑制作用。结果发现：降压药氯沙坦（原本用于阻断血管紧张素 Ⅱ 受体）能显著降低 TGFβ1 诱导的 SMAD3 磷酸化，且抑制胶原沉积—— 符合“调节 TGFβ 通路”的表型需求。

3. 验证新用途：

在 COL7A1 突变的 RDEB 小鼠模型中，氯沙坦（30mg/kg，每日灌胃）处理 8 周后：

⩤   小鼠前爪慢性损伤区域的 TGFβ 通路活性下降；

⩤   皮肤水疱发生率降低，胶原纤维排列紊乱程度减轻

【证明氯沙坦能缓解 RDEB 病理表型】

4. 临床关联：

对 5 例难治性 RDEB 患者进行同情用药，口服氯沙坦（50mg / 日）6 个月后：

⩤   患者皮肤破裂愈合时间从平均 21 天缩短至 14 天；

⩤   血清中 TGFβ1 水平下降 30%，且不良反应发生率为0% —— 为后续 Ⅱ 期临床试验奠定基础。

思路总结：从 “FDA库筛选”到“临床前候选药”——洛美他派的PDD完整链路

以场景1中的洛美他派为例，复盘PDD在“老药新用+靶点挖掘”中的全流程价值：

1. 表型启动：从1056种FDA批准药物中，通过WST-1assay筛选出洛美他派（降脂药）对CRC细胞的抑制活性，确定“自噬激活”为核心表型；

2. 靶点筛选：用LiP-SMap排除11个非特异性结合蛋白，锁定PP2A为关键靶点，SPR验证直接结合；

3. 功能验证：CRISPR敲除PP2A后药效消失，动物实验确认肿瘤抑制和安全性，机制实验解析AMPK/Beclin1通路；

4. 临床转化：基于PP2A结合位点优化洛美他派结构，新化合物对CRC细胞的IC50从2.3μM降至0.8μM，且对正常结肠细胞毒性降低（IC50>50μM），目前已进入临床前安全性评价。

小结与预告

今天我们通过3个高分案例，拆解了PDD的核心路径：以“药物表型”为起点，用LiP-SMap、SIP、高通量筛选等技术，反向锁定“治疗靶点”（如PP2A）、排查“脱靶靶点”（如NDUFV1）、挖掘“新用途”（如氯沙坦治RDEB）。PDD的关键优势是“贴近临床实际”——无需预设靶点假设，直接从药效出发，尤其适合老药新用和复杂疾病（如CRC、罕见病）的靶点挖掘。

但如果我们已明确某个关键靶点（如CRC中的PP2A、TED中的IL-6），想针对性开发新药，又该如何设计筛选策略？明天“药物靶点研究3天入门”的第三天，我们将聚焦基于靶点的药物研发（Target-based Drug Discovery, TDD），教你用虚拟筛选、活性探针、PROTAC等技术开发药物，尤其破解“不可成药靶点”的难题。

参考资料

[1] Zuo Q, Liao L, Yao ZT, et al. Targeting PP2A with lomitapide suppresses colorectal tumorigenesis through the activation of AMPK/Beclin1-mediated autophagy. Cancer Lett. 2021;515:125-138. doi:10.1016/j.canlet.2021.09.010

[2] Moffat JG, Vincent F, Lee JA, et al. Opportunities and challenges in phenotypic drug discovery: an industry perspective. Nat Rev Drug Discov. 2017;16(8):531-543. doi:10.1038/nrd.2017.111

[3] Zhang XL, Wang Q, Li YN, et al. Solvent-induced protein precipitation for drug target discovery on proteomic scale. Anal Chem. 2019;91(24):15356-15363. doi:10.1021/acs.analchem.9b04531